IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトシド）はβ-ガラクトシダーゼ基質の類似体であり、誘導性が非常に高い。IPTGの誘導下では、誘導物質が抑制タンパク質と複合体を形成し、抑制タンパク質の立体構造が変化するため、標的遺伝子と結合できなくなり、標的遺伝子が効率的に発現する。では、実験中にIPTGの濃度はどのように決定すべきだろうか？濃度が高いほど良いのだろうか？
まず、IPTG誘導の原理を理解しましょう。大腸菌のラクトースオペロン（要素）には、β-ガラクトシダーゼ、パーミアーゼ、アセチルトランスフェラーゼをそれぞれコードする3つの構造遺伝子、Z、Y、Aが含まれています。lacZはラクトースをグルコースとガラクトース、またはアロラクトースに加水分解します。lacYは環境中のラクトースが細胞膜を通過して細胞内に入ることを可能にします。lacAはアセチルCoAからβ-ガラクトシドにアセチル基を転移させ、毒性効果を除去します。さらに、操作配列O、開始配列P、および調節遺伝子Iがあります。I遺伝子コードは、操作配列のOの位置に結合できるリプレッサータンパク質であり、これによりオペロン（メタ）が抑制され、オフになります。開始配列Pの上流には、異化遺伝子活性化タンパク質（CAP）結合部位も存在する。P配列、O配列、およびCAP結合部位は、ラクトースオペロンの制御領域を構成する。これら3つの酵素のコード遺伝子は、同じ制御領域によって制御され、遺伝子産物の協調的な発現が実現される。
ラクトースが存在しない場合、lacオペロン（メタ）は抑制状態にある。このとき、PIプロモーター配列の制御下にあるI配列によって発現されるlacリプレッサーがO配列に結合し、RNAポリメラーゼがP配列に結合するのを妨げ、転写開始を阻害する。ラクトースが存在すると、lacオペロン（メタ）は誘導される。このオペロン（メタ）システムでは、実際の誘導物質はラクトースそのものではない。ラクトースは細胞内に入り、β-ガラクトシダーゼによって触媒されてアロラクトースに変換される。後者は誘導分子としてリプレッサータンパク質に結合し、タンパク質の立体構造を変化させ、リプレッサータンパク質がO配列から解離して転写が始まる。イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）はアロラクトースと同じ効果を持つ。これは非常に強力な誘導物質であり、細菌によって代謝されず、非常に安定しているため、研究室で広く使用されている。
IPTGの最適濃度をどのように決定するか？大腸菌を例にとってみよう。
ポジティブ組換えpGEX（CGRP/msCT）を含む遺伝子組換え大腸菌BL21株を、50μg·mL-1 Ampを含むLB液体培地に接種し、37℃で一晩培養した。上記の培養液を、50μg·mL-1 Ampを含む50mLの新鮮なLB液体培地10本に1:100の比率で接種して増殖培養を行い、OD600値が0.6～0.8になった時点で、最終濃度が0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mmol·L-1になるようにIPTGを添加した。同じ温度と時間で誘導した後、細菌溶液1 mLを採取し、遠心分離によって細菌細胞を回収し、SDS-PAGEに供して、異なるIPTG濃度がタンパク質発現に及ぼす影響を分析し、タンパク質発現が最も大きいIPTG濃度を選択した。
実験の結果、IPTGの濃度はできるだけ高くする必要はないことが分かりました。これは、IPTGが細菌に対して一定の毒性を持っているためです。濃度が高すぎると細胞が死滅してしまいます。また、一般的に、細胞内で発現する可溶性タンパク質が多いほど良いとされていますが、IPTGの濃度が高すぎると、大量の封入体が形成され、可溶性タンパク質の量が減少してしまう場合が多くあります。したがって、最適なIPTG濃度は、濃度が高いほど良いというわけではなく、低いほど良い場合が多いのです。
遺伝子組換え株の誘導および培養の目的は、目的タンパク質の収量を増加させ、コストを削減することです。目的遺伝子の発現は、株自身の因子や発現プラスミドだけでなく、誘導物質の濃度、誘導温度、誘導時間などの外部条件にも影響されます。したがって、一般的に、未知のタンパク質を発現・精製する前に、誘導時間、温度、IPTG濃度を検討し、適切な条件を選択して最良の実験結果を得ることが推奨されます。
投稿日時：2021年12月31日